N-Methyltransferase Glisin Sebagai Contoh Keragaman Fungsional

Sitokrom P-4501A1 (CYP1A1) gen diatur oleh beberapa faktor yang bekerja lintas termasuk 4S polycyclic aromatik hidrokarbon (PAH)-binding protein, yang baru-baru ini diidentifikasi sebagai N-methyltransferase glisin (GNMT). Peran GNMT sebagai 4S PAH-binding protein dalam menengahi induksi sitokrom P-4501A1 telah diteliti lebih lanjut. GNMT cDNA, yang clone menjadi vektor pMAMneo berisi virus Rous sarcoma promotor dan gen resistensi neomisin, itu secara stabil ditransfer ke ovarium D422 hamster cina (CHO) sel. Bukti yang telah dipublikasikan menunjukkan bahwa tikus induksi CYP1A1 setelah pengobatan dengan PAHs, seperti B[a]P atau B[e]P, mungkin memerlukan reseptor-Ah jalur independen dimediasi oleh protein reseptor cytosolic lain, 4S PAH - binding protein. Baik Ah reseptor dan 4S PAH-binding protein mengikat ligan berbeda menunjukkan kekhususan, dengan 3-methylcholanthrene berinteraksi dengan keduanya. B[a]P dan B[e]P telah dibuktikan untuk bertindak semata-mata sebagai ligan untuk 4S protein dalam hati tikus dan sel-sel hepatoma tikus. Seperti reseptor Ah, yang 4S nuklir mengalami translokasi protein pada interaksi dengan PAH dan kompleks untuk respon cis-elemen di berbagai daerah peraturan CYP1A1. 4S protein yang telah dimurnikan untuk homogenitas menggunakan kromatografi serangkaian langkah, melibatkan pertukaran ion, gel perembesan, interaksi hidrofobik, dan afinitas chromatographies. Parsial sequencing dari 33-kDa protein 4S menunjukkan identitasnya sebagai GNMT. Berdasarkan sejumlah kriteria, GNMT dan 4S PAH-binding protein diperlihatkan untuk menjadi satu dan protein yang sama. Diperkirakan bahwa enzim ini dapat hadir dalam konsentrasi tinggi dalam hati tikus dan manusia, meskipun tingkat tinggi protein ini dalam jaringan manusia, peran fisiologis GNMT tidak dipahami dengan baik. GNMT pertama kali ditemukan dalam ekstrak hati guinea pig dan dalil untuk terlibat dalam oksidasi karbon metil dari metionin, meskipun account jalur ini hanya 20% dari total metil metabolisme metionin. Kemudian, Kerr menyatakan bahwa enzim mungkin memainkan peran dalam regulasi tingkat relatif ofS-adenosylmethionine dan S-adenosylhomocysteine dalam sel. Dalam sebuah studi berikutnya oleh Cook dan Wagner, GNMT ditunjukkan untuk bertindak sebagai folat mengikat protein dalam sitosol hati tikus. Tikus GNMT, dalam peran enzimatik, adalah homotetramer terdiri dari 33-kDa sub unit; independen tersedia situs pengikatan Fors-adenosylmethionine, glisin, dan folat dan juga untuk B[a]P. Bentuk enzim GNMT, iethe homotetramer, tidak aktif sebagai B[a]P-binding protein, dan monomer tidak dapat berfungsi baik enzimatik atau sebagai B[a]P pengikat. Bukti awal menunjukkan homodimer sebagai fungsional B[a]P-mengikat unit. GNMT cDNA ini disintesis oleh RT-PCR metodologi dari hati tikus poli (A) + RNA persiapan. GNMT spesifik yang maju dan reverse primer adalah 5'-GAGCCAGCTAGCGTCAGGATGGTGGAC dan 5'-TGGGAGCTCGAGCCAGGCTCAGCCTGT, masing-masing. Produk ini selanjutnya dimurnikan dengan gel agarosa electophoresis, dan urutan ini ditunjukkan untuk menjadi identik dengan diterbitkan GNMT cDNA. Dua kloning NheI dan XhoI situs untuk dimasukkan ke dalam daerah di noncoding cDNA GNMT oleh metodologi PCR. Yang disucikan DNA beruntai ganda Produk ini diligasi ke NheI/XhoI-dicerna pMAMneo (CLONTECH, Palo Alto, CA). Plasmid membangun, pMAMneo/GNMT, berisi GNMT masukkan dari ukuran yang sesuai dalam arti orientasi seperti yang ditentukan oleh urutan pembatasan pencernaan dan tekad. pMAMneo/GNMT adalah transfected ke sel CHO oleh metode Lipofectin. Secara singkat, pada hari 0, 10 μg DNA dalam 100 μl of Opti-MEM aku dicampur dengan 15 μl dari Lipofectin reagen, dilapisi ke sekitar 2×105 sel dalam 2 ml serum pertumbuhan bebas menengah, dan diinkubasi selama 24 jam pada 37°C dalam inkubator CO2. DNS transfectants didirikan menggunakan DNA dari plasmid pMAMneo orangtua. Pada hari 1, DNA mengandung menengah digantikan oleh standar pertumbuhan serum-termasuk menengah, dan inkubasi dilanjutkan untuk tambahan 48 jam. Pada hari 4, sel-sel ditempatkan dalam medium yang mengandung pilihan geneticin (0,4mg/ml). Klon sel tunggal yang dipetik, ditanam di medium seleksi, dan diuji untuk GNMT ekspresi melalui Western blotting dan B[a]P kegiatan mengikat. SDS-Polyacrylamide Gel Elektroforesis dan Western blotting. Klon yang sudah dewasa dalam keadaan medium mengandung esensial minimal 0,4 mg/ml G418, 10% dialyzed serum janin sapi, dan 1 μm deksametason. Dalam penyelidikan sekarang, secara stabil GNMT ini diperkenalkan ke CHO sel-sel, yang tidak memiliki ekspresi endogen protein ini serta reseptor Ah, dengan menggunakan plasmid yang berisi virus Moloney ulangi terminal lama sebagai promotor dan dipamerkan neomisin perlawanan sebagai penanda seleksi. Jika hipotesis GNMT, 4S PAH-binding protein, sebagai mediator dari PAH-induksi ekspresi CYP1A1 berlaku, sistem sekarang harus menanggapi B[a]P dalam cara yang sesuai. Hasil penelitian kami menunjukkan bahwa pengenalan ekspresi GNMT ke sel CHO ini pada kenyataannya tidak menyebabkan PAH-induksi ekspresi CYP1A1. Selanjutnya, penafsiran ini diperkuat oleh tidak adanya tingkat dideteksi Ah reseptor dalam baris sel ini. Kami juga telah tidak dapat mendeteksi setiap mRNA untuk Ah reseptor pada orangtua, vektor-berubah, atau pMAMneo/GNMT-sel berubah (data tidak ditampilkan), juga telah kami mendeteksi setiap TCDD mengikat mengikat dan kegiatan XRE dibuktikan dalam sel-sel ini. Sebelumnya, B[e]P telah menunjukkan untuk menjadi ligan selektif untuk 4S PAH-binding protein. Dalam penelitian ini, kami telah menunjukkan bahwa PAH ini juga dapat mempengaruhi ekspresi CYP1A1 dalam GNMT-sel CHO transfected, sedangkan TCDD, sebuah prototypic ligan untuk reseptor Ah, gagal untuk melakukannya. Hasil ini jelas menunjukkan peran GNMT sebagai mediator dari ekspresi CYP1A1 yang disebabkan oleh berbagai PAHs seperti B[a]P, B[e]P, dan 3-methylcholanthrene melalui reseptor-Ah jalur independen. GNMT memiliki pengikatan nukleotida daerah (43) dan telah diterjemahkan dalam inti hati tikus oleh berbagai teknik imunohistokimia (56). GNMT juga telah diusulkan sebagai ekspresi gen modulater oleh metilasi dari substrat yang belum teridentifikasi (43). Bisa dibayangkan bahwa GNMT dapat bertindak secara tidak langsung dalam modulasi B [a] P-induksi CYP1A1 oleh ungkapan yang tidak dikenal methylating substrat yang dapat mempengaruhi gen ini, karena hypermethylation telah ditunjukkan oleh banyak laboratorium untuk mempengaruhi aktivitas gen. Hasil sekarang menunjukkan bahwa pameran GNMT fungsi beragam, salah satunya sebagai sebuah enzim dan yang lain sebagai penggerak transkripsional. Aspek ekonomi molekuler tidak unik untuk GNMT tetapi dipakai oleh beberapa protein lain yang berfungsi sebagai enzim dan aktivator. Beberapa enzim dalam jalur glikolitik telah terbukti menjadi pengikat DNA protein. Sebagai contoh, 37-kDa subunit gliseraldehida-3-fosfat dehidrogenase juga melayani dalam perbaikan DNA sama sekali tidak terkait berfungsi sebagai DNA urasil glycosylase. Salah satu dari dua pengakuan primer protein yang merangsang aktivitas DNA polimerase-α dalam replikasi telah diidentifikasi sebagai 3-phosphoglycerate kinase. Kultur jaringan media, α-minimal esensial media, serum janin sapi, gentamycin, geneticin (G418), dan Lipofectin tersebut dibeli dari Life Technologies, Inc Kode sumber dari bahan-bahan lain: [α-32P] dATP dari ICN biokimia (Irvine , CA); [3H] B[a]P (60 Ci / mmol) dari Amersham Corp; [3H] TCDD (41 Ci / mmol) dari Chem-Syn Science Labs (Lenexa, KS); Immobilon P dari Millipore ( Bedford, MA); S & S mentransfer membran dari Schleicher & Schuell; BM Chemiluminescence blotting Barat kit dari Boehringer Mannheim Biochemica Corp; Tris, TEMED, Tween 20, B[a]P, B[e]P, 3-methylcholanthrene, TCDD, Isositrat dehidrogenase, nikotinamida, ethoxyresorufin, dan resorufin dari Sigma. Afinitas-dimurnikan antibodi terhadap Ah GNMT dan reseptor itu murah hati hadiah dari Dr Conrad Wagner (Vanderbilt University) dan Dr Bill Greenlee (University of Massachusetts Medical Center), masing-masing. Ah reseptor yang mengandung plasmid cDNA ini baik yang disediakan oleh Dr Chris Bradfield (University of Wisconsin). Dalam penyelidikan sekarang, secara stabil GNMT ini diperkenalkan ke CHO (D422) sel-sel, yang tidak memiliki ekspresi endogen protein ini serta reseptor Ah, dengan menggunakan plasmid yang berisi virus Moloney ulangi terminal lama sebagai promotor dan dipamerkan neomisin perlawanan sebagai penanda seleksi. Jika hipotesis GNMT, 4S PAH-binding protein, sebagai mediator dari PAH-induksi ekspresi CYP1A1 berlaku, sistem sekarang harus menanggapi B[a]P dalam cara yang sesuai. Hasil penelitian kami menunjukkan bahwa pengenalan ekspresi GNMT ke sel CHO ini pada kenyataannya tidak menyebabkan PAH-induksi ekspresi CYP1A1. Selanjutnya, penafsiran ini diperkuat oleh tidak adanya tingkat dideteksi Ah reseptor dalam baris sel ini. Kami juga telah tidak dapat mendeteksi setiap mRNA untuk Ah reseptor pada orangtua, vektor-berubah, atau pMAMneo/GNMT-sel berubah (data tidak ditampilkan), juga telah kami mendeteksi setiap TCDD mengikat mengikat dan kegiatan XRE dibuktikan dalam sel-sel ini. Hasil sekarang menunjukkan bahwa pameran GNMT fungsi beragam, salah satunya sebagai sebuah enzim dan yang lain sebagai penggerak transkripsional. Aspek ekonomi molekuler tidak unik untuk GNMT tetapi dipakai oleh beberapa protein lain yang berfungsi sebagai enzim dan aktivator. Beberapa enzim dalam jalur glikolitik telah terbukti menjadi pengikat DNA protein (63). Sebagai contoh, 37-kDa subunit gliseraldehida-3-fosfat dehidrogenase juga melayani dalam perbaikan DNA sama sekali tidak terkait berfungsi sebagai DNA urasil glycosylase (64). Salah satu dari dua pengakuan primer protein yang merangsang aktivitas DNA polimerase-α dalam replikasi telah diidentifikasi sebagai 3-phosphoglycerate kinase. Bagaimana dan dengan apa mekanisme GNMT mampu memenuhi dua fungsi yang tidak terkait dalam sistem kehidupan perlu penyelidikan lebih lanjut. GNMT merupakan sekitar 1% dari total selular protein dalam hati tikus dan kelinci. Enzimatik, GNMT harus hadir sebagai homotetramer, yang mewakili bentuk utama. Di sisi lain, itu adalah bentuk dimer yang berfungsi sebagai mengikat PAH-unit dan transkripsional activitor. Kami juga baru-baru ini melaporkan bahwa keadaan fosforilasi GNMT mempengaruhi pengikatan B[a]P dan translokasi nuklirnya. Bisa dibayangkan bahwa sejauh mana subselular dimerization dan lokalisasi GNMT diatur oleh modifikasi pasca-translasi peristiwa seperti yang telah dilaporkan untuk trans-acting lain faktor. Unpublished kami studi menunjukkan bahwa fosforilasi yang terlibat dalam menstabilkan PAH-bentuk yang mengikat (dimer) dari protein. Akibatnya, tingkat-faktor pembatas dalam menentukan jumlah transkripsional fungsional penggerak adalah keadaan fosforilasi bentuk dimer GNMT dan konsentrasi intraselular PAH. Jumlah homotetramer, yaitu bentuk utama GNMT, tidak relevan. Sebagai kesimpulan kami telah menunjukkan bahwa PAH GNMT adalah mengikat protein yang menjadi perantara induksi CYP1A1 oleh Ah reseptor-jalur independen. Penyelidikan tambahan diperlukan untuk lebih memahami faktor-faktor yang mengatur jumlah dan karena itu dimer GNMT mengendalikan ekspresi CYP1A1.